能夠想到四個(gè)重要因素影響背景是亮還是暗(我的經(jīng)驗(yàn)來(lái)自生物學(xué)的組織/細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)):
1. 光圈。光圈開(kāi)得大,顧名思義所有光信號(hào)包括背景信號(hào)都會(huì)增強(qiáng)。
2. 曝光時(shí)間。光信號(hào)再?gòu)?qiáng),你只選取其中很少一部分來(lái)成像,也能夠控制圖像中的信號(hào)強(qiáng)度。
3. 樣品/玻片本身的自發(fā)熒光。
4. 樣品的非特異性染色。
總體是一個(gè)所有檢測(cè)手段中共通的問(wèn)題,即信噪比,信號(hào)與噪聲比率。
1,2對(duì)信噪比影響不大,在背景過(guò)強(qiáng)時(shí)很難通過(guò)調(diào)整1,2來(lái)解決問(wèn)題。如果背景不存在過(guò)強(qiáng)問(wèn)題,則通過(guò)1確保有用信號(hào)足夠強(qiáng),通過(guò)2減低曝光時(shí)間至背景充分黑暗即可。
3,4才是控制信噪比的關(guān)鍵因素。自發(fā)熒光無(wú)法完全避免,只能通過(guò)選取自發(fā)熒光較低的材料來(lái)控制,另外固定及染色過(guò)程中的一些試劑有可能影響樣本的自發(fā)熒光。非特異性染色是更為常見(jiàn)的造成背景問(wèn)題的原因,通過(guò)優(yōu)化封閉條件,抗體/試劑用量,染色時(shí)長(zhǎng)與溫度等條件來(lái)調(diào)整。